蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法
蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法一般來(lái)說(shuō)，有以下五種：凱氏定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。
表 五種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較
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方法 |
靈敏度 |
時(shí)間 |
原理 |
干擾物質(zhì) |
說(shuō)明 |
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凱氏定氮法 （Kjedahl法） |
靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2％ |
費(fèi)時(shí) 8～10小時(shí) |
將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定 |
非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） |
用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng) |
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雙縮脲法（Biuret法） |
靈敏度低 1～20mg |
中速 20~30分鐘 |
多肽鍵＋堿性Cu2＋®紫色絡(luò)合物 |
硫酸銨； Tris緩沖液； 某些氨基酸 |
用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似 |
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紫外吸收法 |
較為靈敏 50～100mg |
快速 5～10分鐘 |
蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 |
各種嘌吟和嘧啶； 各種核苷酸 |
用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸的吸收可以校正 |
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Folin－酚試劑法（Lowry法） |
靈敏度高 ～5mg |
慢速 40～60 分鐘 |
雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 |
硫酸銨； Tris緩沖液； 甘氨酸； 各種硫醇 |
耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
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考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法) |
靈敏度最高 1～5mg |
快速 5～15分鐘 |
考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm |
強(qiáng)堿性緩沖液； TritonX-100; SDS |
最好的方法； 干擾物質(zhì)少； 顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
從以上表格中可以得出，不同的方法有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，如紫外吸收法測(cè)定時(shí)間快。但是綜合起來(lái)，最后一種考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)效率最高，無(wú)論是測(cè)定時(shí)間，靈敏度還是受干擾程度，都是比較占優(yōu)勢(shì)的。
下面，我們來(lái)重點(diǎn)介紹一下其中一種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法--凱氏定氮法。
凱氏定氮法（Kjedahl法）
首先將濃硫酸倒入樣品中，邊倒邊搖晃，以使?jié)饬蛩崤c樣品充分接觸，然后加熱試劑。如果你需要加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，可以加入CuSO4作催化劑，這樣，實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間就會(huì)大大縮短。CH2COOH和H2SO4反應(yīng)生成氨氣，然后氨氣又與H2SO4發(fā)生作用，固定了氮元素。這時(shí)我們得到了(NH4)2SO4的溶液，然后我們可以用NaOH去跟硫酸銨反應(yīng)，通過(guò)計(jì)算NaOH的使用量，就可以計(jì)算出氮的含量。下面是整個(gè)定氮法中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。
CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
當(dāng)我們得到氮的含量以后，我們就可以通過(guò)一定的計(jì)算，最終算出蛋白質(zhì)的含量。
凱氏定氮法常用于有機(jī)化合物中的氮含量的測(cè)定，是蛋白質(zhì)含量測(cè)定的經(jīng)典方法，雖然在測(cè)試過(guò)程中，試劑用量很大，但是，不可否認(rèn)，它所適用的樣品范圍之廣，測(cè)試結(jié)果之精確，都是公認(rèn)的。
